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WIWAM高通量植物表型成像系統(tǒng)—擬南芥和玉米轉(zhuǎn)基因品系的功能分析

更新時間:2022-05-24 點擊量:1752

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保守的聚(ADP-核糖基)化(PAR)途徑由三個遺傳成分組成,它們是調(diào)節(jié)植物在脅迫下的能量穩(wěn)態(tài)的潛在目標(biāo),目的是提高作物的產(chǎn)量穩(wěn)定性并幫助確保糧食供應(yīng)。我們通過在擬南芥和玉米 (Zea mays) 中使用轉(zhuǎn)基因方法研究了PAR途徑組分ADP-核糖/NADH 焦磷酸水解酶 (AtNUDX7) 在產(chǎn)量和輕度干旱脅迫中的作用。擬南芥AtNUDX7 cDNA分別通過花椰菜花葉病毒35S啟動子和強啟動子Brachypodium distachyon pBdEF1a在擬南芥和玉米中過表達(dá)。AtNUDX7在擬南芥中的過度表達(dá)改善了通過一種新的自動化方法測量的種子參數(shù),加速了開花并降低了花序高度。這種有益特性的組合表明,擬南芥中的 AtNUDX7 過表達(dá)可能會通過在聚(ADP-核糖基)化能量穩(wěn)態(tài)途徑中提供 ATP 源來增強 ADP-核糖再循環(huán)步驟并維持能量水平。在自動化平臺上分析了 AtNUDX7 基因高、中和低過表達(dá)水平的擬南芥和玉米品系,并在輕度干旱脅迫條件下確定了幾個生長參數(shù)的抑制作用。數(shù)據(jù)顯示,擬南芥AtNUDX7基因在擬南芥和玉米中不同水平的組成性過表達(dá)并沒有提高對輕度干旱脅迫的耐受性,但下調(diào)AtNUDX7的表達(dá)確實提高了耐性,但在正常條件下以犧牲一般生長為代價。

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AtNUDX7 基因 (AT4G12720) 的全長 cDNA 在組成型花椰菜花葉病毒35S啟動子控制下使用植物網(wǎng)關(guān)表達(dá)載體pK2GW7在擬南芥哥倫比亞 (Col-0) 種質(zhì)中過表達(dá),其攜帶新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶 II (nptII) 選擇標(biāo)記基因(圖1A)?;ńD(zhuǎn)化后,在含卡那霉素的培養(yǎng)基上以高密度平板選擇 T0 轉(zhuǎn)基因擬南芥植物,隨后鑒定出具有單基因座純合 T-DNA 插入的 T3 品系。p35S::AtNUDX7 系和 Col-0 對照植物的兩周大T3幼苗用于定量 (q) PCR 表達(dá)分析。與 Col-0 對照相比,在 10 個獨立的轉(zhuǎn)基因 p35S::AtNUDX7 系中觀察到 AtNUDX7 的高、中和低過表達(dá)水平,范圍在 2 倍到 50 倍之間(圖1B)。我們將其命名為 Atnudx7-1 (SALK-046441) 的功能喪失突變株系,在 Col-0 背景中在 AtNUDX7 基因的外顯子 1 中插入了 T-DNA,驗證了其 T-DNA 插入位置,純合 T-DNA 插入,AtNUDX7 基因表達(dá),并用作陰性對照(圖 1C)。:種子產(chǎn)量;開花時間;水分虧缺;輕度干旱脅迫;組成型啟動子。

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圖1.AtNUDX7在擬南芥和玉米中的過表達(dá)

研究了兩個高過表達(dá)(OE) 系 AtNUDX7_OE-At1 和 AtNUDX7_OE-At2、中等OE系A(chǔ)tNUDX7_OE-At3、低OE系A(chǔ)tNUDX7_OE-At5、Atnudx7-1 突變系(Salk -046441_1) 和 Col-0 控制線。呈現(xiàn)并總結(jié)了為p35S::AtNUDX7 OE 系、Atnudx7-1 突變系和 Col-0 對照系確定的種子產(chǎn)量和產(chǎn)量相關(guān)參數(shù)(圖2,3)。與 Col-0 相比,高OE品系A(chǔ)tNUDX7_OEAt2 每株植物的總種子重量顯著增加,每 10 個長角果的種子數(shù)(種子數(shù))顯著增加,種子質(zhì)量和大小與 Col-0 相當(dāng)。在中等 OE 品系 AtNUDX7_OE-At3 中可以看到種子數(shù)量、種子大小和每粒種子質(zhì)量的顯著增加,但在總種子重量中沒有。通過稱重*成熟和干燥時收獲的總種子來確定總種子重量,而成像用于確定種子數(shù)量和種子大小。如(材料和方法)所述計算每粒種子的質(zhì)量。盡管 AtNUDX7_OE-At3 中的種子數(shù)量、種子大小和每粒種子的質(zhì)量有所增加,但獲取種子參數(shù)的方法的差異可能是總種子重量沒有增加的原因。在低 OE 系 AtNUDX7_OE-At5 中,每株植物的總種子重量也顯著增加,而種子數(shù)、種子大小和每粒種子質(zhì)量保持不變(圖2和3)。在重復(fù)實驗中,在相同的三個AtNUDX7 OE_At2、AtNUDX7 OE_At3 和 AtNUDX7 OE_At5 品系中測量了改進(jìn)的種子產(chǎn)量參數(shù),但在高和中OE品系中比在低OE品系中更顯著。

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圖2.T3 p35S::AtNUDX7 擬南芥過表達(dá)系、Atnudx7-1突變系(SALK-046441_1) 和Col-0系的種子產(chǎn)量和開花時間參數(shù)

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圖3. 四個T3 p35S:AtNUDX7過表達(dá)系和AtNUDX7-1突變系種子產(chǎn)量和開花時間參數(shù)的熱圖

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圖4.在輕度干旱脅迫實驗中測量的終點參數(shù),以比較純合pBdEF1a::AtNUDX7 過表達(dá) T3 玉米品系、AtNUDX7_OE-Zm1、AtNUDX7_OE-Zm2 和 AtNUDX7_OEZm3 與 B104 對照玉米在充足澆水和缺水條件下

每天測量第4片葉子的長度,從植物的基部到葉尖,從外觀到成熟,并用于確定葉子的生長速率。當(dāng)?shù)?片葉片停止生長時,測量其葉片重量、葉片和葉鞘重量、葉片寬度、總?cè)~面積以及幼苗的鮮重和干重。分析了三個T3純合玉米系A(chǔ)tNUDX7_OE-Zm1、AtNUDX7_OE-Zm2和AtNUDX7_OE-Zm3,分別具有AtNUDX7基因的高、中、低過表達(dá)水平,以及B104對照系。水分虧缺時,高表達(dá)和低表達(dá)玉米系A(chǔ)tNUDX7_OE-Zm1和AtNUDX7_OE-Zm3在所有測量參數(shù)中的減少百分比均高于B104野生型,盡管沒有統(tǒng)計學(xué)意義。然而,在水分虧缺條件下中等過表達(dá)系A(chǔ)tNUDX7_OE-Zm2的葉片4葉片重量、葉片和葉鞘重量、葉片寬度和總?cè)~面積比B104對照組分別減少15%、16%、9%和15%(圖4),而AtNUDX7_OE-Zm2品系在水分虧缺條件下的植物生物量和植物干重減少與B104玉米對照沒有統(tǒng)計學(xué)差異(圖4)。此外,水分虧缺處理后,三個AtNUDX7過表達(dá)玉米系的葉4生長減少百分比與B104對照沒有顯著差異。在自動化平臺上進(jìn)行了三次重復(fù)的缺水試驗;在前兩個實驗中,每個基因型的個體較少,大多數(shù)參數(shù)與B104玉米對照沒有顯著差異。


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